CRISPR/Cas

CRISPR/Cas (uitgesproken als krisper/kas) is een methode om een mutatie te genereren op een vooraf bepaalde plaats in het planten-DNA. In CRISPR/Cas staat CRISPR staat voor Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats en Cas voor CRISPR-associated. De technologie is ontwikkeld met het CRISPR/Cas-verdedigingssysteem van bacteriën tegen virussen als basis.

Een breuk in het DNA 
CRISPR/Cas is een vorm van site-directed nuclease-technologie, wat vertaald kan worden naar ‘plaats-specifieke nuclease’. Nucleasen zijn enzymen die een breuk maken in DNA. Ze zijn te vergelijken met een schaar – op moleculaire grootte– die DNA knipt. Specifieke nucleasen knippen DNA niet zo maar. Ze doen het enkel wanneer ze specifieke plaatsen in het DNA herkennen. Zo’n herkenningsplaats wordt bepaald door een opeenvolging van vier of meer DNA-bouwstenen, afhankelijk van het nuclease. Er bestaat een grote verscheidenheid aan nucleasen die allemaal andere DNA-sequenties herkennen.

Breuk herstellen op 2 verschillende manieren 
Wanneer DNA doormidden geknipt wordt, zal het natuurlijk herstellingsmechanisme van een plant de breuk proberen herstellen. Er kunnen zich twee scenario’s voordoen. In het eerste geval worden de eindjes terug aan elkaar gezet via een proces dat ‘niet-homologe samenvoeging van de uiteinden’ wordt genoemd. In dit proces sluipen echter vaak fouten waardoor een of meerdere DNA-bouwstenen verdwijnen of toegevoegd worden (Figuur).
In het andere geval kan de breuk hersteld worden met een stuk DNA dat aan de uiteinden een grote sequentie-overeenkomst (homologie) met de breuk vertoont. Dit wordt homologie-gestuurd DNA-herstel genoemd. Via deze methode kan dus een nieuw DNA-fragment ingebouwd worden of kan een fragment ingevoegd worden zodat de oorspronkelijke sequentie hersteld wordt maar met een of meerdere doelbewuste fouten. Met beide herstellingsmechanismen wordt de originele DNA-code op een specifieke plaats veranderd.


Figuur SDN -1 EN -2

Breuk induceren en nadien op verschillende manieren te herstellen


Het belang van de herkenningssequentie  
De meeste nucleasen knippen DNA op basis van een korte herkenningssequentie. Wanneer deze nucleasen zonder meer losgelaten worden op het planten-DNA zal het DNA op te veel plaatsen geknipt worden. Immers, hoe kleiner een sequentie, hoe groter de kans dat die sequentie door toeval aanwezig is in het DNA. Om een nuclease zijn knipfunctie enkel op een specifieke plaats te laten uitoefenen moet het ofwel een voldoende lange herkenningssequentie hebben ofwel gekoppeld worden aan een andere molecule die zorgt voor de specificiteit. Bij CRISPR/Cas wordt de specificiteit van de schaar (nuclease) verkregen door het te koppelen aan een RNA-molecule.

Binnenbrengen in de planten
Het CRISPR/Cas-systeem werd al succesvol toegepast in de modelplanten Arabidopsis en tabak maar ook bij gewassen zoals tarwe, maïs, rijst en tomaat. Voor CRISPR/Cas geldt dat vooraleer er mutaties kunnen gegenereerd worden, moet de nuclease gekoppeld aan de leidende RNA-molecule binnengebracht worden in de plantencel. Dit kan op verschillende manieren gebeuren, maar telkens is het finale resultaat een plant met een of meerdere mutaties in een specifiek gen die niet meer te onderscheiden is van een plant die via klassieke mutatieveredeling is ontwikkeld. Wetenschappelijk gezien zijn er dan ook geen argumenten om deze planten op vlak van risicoanalyse anders te evalueren dan planten verkregen via de klassieke mutatieveredeling.

Binnenbrengen via GGO-technologie 
De genetische informatie voor de productie van de specifieke nuclease wordt dan stabiel in het planten-DNA ingebouwd. De plant die op deze manier gecreëerd wordt, zal de CRISPS/Cas-moleculen aanmaken waarna ze hun functie kunnen uitvoeren. Na het creëren van de mutatie(s) zijn die moleculen en het overeenkomstig DNA van geen nut meer. Het GGO-tussenproduct zal ingezet worden in een kruisingsprogramma waarbij nakomelingen geselecteerd worden die wel de mutatie overgeërfd hebben maar de CRISPR/Cas-genen niet meer bezitten.

Rechtstreeks binnenbrengen 
Alternatief kan het nuclease en de bijhorende RNA-molecule onder vorm van RNA in een plantencel gebracht worden met behulp van plantenvirussen of rechtstreeks als eiwit-RNA complex. In beide gevallen wordt er geen erfelijk materiaal ingebouwd in het planten-DNA. In dit geval wordt nergens in het proces een GGO-plant gemaakt of gebruikt. Na het uitvoeren van hun muterende taak worden nuclease en RNA spontaan afgebroken door de plantencel.


 

 Nieuws ‭[3]‬

 
 

 Educatief ‭[3]‬

 
 

 Nieuws ‭[2]‬

 
 

 Educatief ‭[2]‬

 
 

 Educatief ‭[1]‬

 
 

 Nieuws ‭[1]‬

 



Schematische voorstelling CRISPR/Cas