47. Maak je favoriete transgene plant: onderzoek naar celdeling in planten met fluorescerende merkers
Algemene info
Mijn project gaat over de celdeling van planten. In ons labo zijn we geïnteresseerd in de speciale structuren die noodzakelijk zijn bij de celdeling, zoals bijvoorbeeld de spoelfiguur die ervoor zorgt dat de chromosomen uit elkaar worden getrokken. Wij willen weten welke eiwitten bij de celdeling belangrijk zijn en wat ze precies doen. We koppelen interessante planteneiwitten aan een fluorescerende merker (GFP; Green Fluorescent Protein) en transformeren plantencellen met dit construct. Op die manier kunnen we met de microscoop deze eiwitten bekijken in levende cellen en hen volgen tijdens de celdeling. Het transformeren van planten met vreemd DNA gebeurt via de Agrobacterium bacterie. Door actieve stoffen te gebruiken die bepaalde processen verstoren, kunnen we zien of ons eiwit zich anders gaat gedragen wat ons veel kan leren over de functie. De rol van de eiwitten van interesse wordt verder onderzocht met behulp van mutanten
- overexpressie van het overeenkomstige gen
- uitschakeling van het gen
Bij deze mutanten wordt gekeken of de celdeling abnormaal verloopt (bijvoorbeeld cellen met meerdere kernen, kleinere planten, onvruchtbare planten) Zo weten we meer over de rol van onze eiwitten in de context van een volledige plant ipv. alleen de cel. De bedoeling van dit project is om meer te weten over hoe de celdeling bij planten precies gebeurt. Wanneer we dit proces beter snappen, kunnen we de vorm en structuur van planten aanpassen, betere onkruidverdelgers uitvinden,… Bovendien kan dit onderzoek ook helpen bij het begrijpen van de dierlijke celdeling en dus bij het onderzoek naar kankermedicijnen.
Omschrijving
- Maken van transgene planten via “floral dip”:
De bloemen van Arabidopsis planten worden ondergedompeld in een bacterie-oplossing (Agrobacterium). De Agrobacteria brengen een vector met een antibiotica-resistentiemerker binnen in de Arabidopsis zaden. De getransformeerde zaden worden geselecteerd op een medium dat het corresponderende antibioticum bevat. De vector bevat ook ons gen van interesse, gefusioneerd met een fluorescerende GFP merker. Na kieming van de plantjes bekijken we met de microscoop waar het fusie-eiwit zich bevindt in de plantencellen. De leerlingen centrifugeren de Agrobacteria, maken de juiste buffer en lossen de bacteriën erin op. Elke leerling gebruikt 1 Arabidopsis plant voor “floral dip”. Vervolgens wordt door de leerlingen selectief plantenmedium gemaakt, geautoclaveerd en in platen gegoten. Er wordt getoond hoe Arabidopsis zaden gesteriliseerd worden. De leerlingen zaaien dan zelf wat zaden uit in de plantenflow. Elke leerling krijgt een getransformeerd Arabidopsis plantje en bekijkt de wortel hiervan met de fluorescentiemicroscoop. Er wordt gekeken naar de lokalisatie van het fluorescerende eiwit in de cel.
- Maken van transgene plantencelculturen:
Om delende cellen te bestuderen, wordt gewerkt met vloeibare plantencelculturen. Deze blijven onbeperkt delen in het juiste medium en ze lijken dan ook wat op kankercellen. De leerlingen voegen met pipetten de juiste hoeveelheden tabakscellen en Agrobacteria samen in de plantenflow. Na incubatie wordt dit mengsel uitgeplaat op selectief medium. Na enkele weken groeien er getransformeerde calli op deze platen. De leerlingen krijgen een aantal van deze calli en moeten met de stereomicroscoop de fluorescerende eruit halen. Deze worden gebruikt om een microscopisch preparaat te maken. Hiermee zullen we de celdeling van levende plantencellen volgen met de confocale microscoop, die ons toelaat om 3D foto’s te nemen.
- Visualisatie van DNA in plantencelculturen:
De plantencellen worden door de leerlingen gefixeerd in een ethanol/acetaat mengsel. Er wordt DAPI toegevoegd, een kleurstof die het DNA kleurt. De leerlingen kijken dan met de fluorescentiemicroscoop naar het DNA tijdens de verschillende fasen van de celdeling (bvb. chromosomen tijdens metafase).
Begeleider
Sylvie Coutuer
Plaats
VIB-dept. voor Planten Systeembiologie
UGent-VIB-Onderzoeksgebouw FSVM
Technologiepark 927
9052 Zwijnaarde
|